乙肝病毒cccDNA检测文档什么是HBVcccDNA?乙型肝炎病毒基因组结构示意图乙型肝炎病毒的复制过程我们为什么要关注HBVcccDNA?为什么没有cccDNA检测试剂盒问世?二、HBVcccDNA检测技术链缺口上游·HBV吸附？暂居？建立感染状态？分离cccDNA和rcDNA的分子基础1cDNA池的自身恒定含量的较低），血清中含量？为什么没有cccDNA检测试剂盒问世?含量在无外来干扰的情况下保Shao,etal.现有的几种cccDNA检测技术简介细胞核内cccDNA含量的相对稳定性，决定了长疗程抗病毒治疗的必要性现有抗病毒药物，包括干扰素和各种核苷类似物，可以一过性地减少cccDNA，但均不能清除cccDNA侵入者探针法(Invaderassay)无论是选择性荧光PCR，还是侵入者探针法或嵌合引物荧光PCR，本身都不能解决在高rcDNA背景条件下的假阳性问题，必须结合抽提分离、酶切纯化等步骤，以提高特异性。乙型肝炎病毒的复制过程持恒定(5－50copy/cell)设计一对特殊引物：跨双缺口引物正义引物P1：与负链互补结合，位于正链缺口上游反义引物P2：与正链互补结合，位于负链缺口下游目的：rcDNA不被扩增选择性PCR：rcDNA不被扩增选择性PCR：cccDNA能被扩增PCR产物自身退火（selfannealing）rcDNA被大量扩增，阳性结果不可靠，定量结果也不可靠HepatologyResearch2003;15:234-243（PBMC）WorldJGastroenterol2004;10(1):82-85(血清)与定性法比较增加了一个荧光探针，探针位于扩增片段区（负链缺口下游），与cccDNA的负链互补。rcDNA不能被扩增无荧光信号实时荧光定量PCR的原理实时荧光定量PCR的原理实时荧光定量PCR的原理标准曲线方程YCtcopy相关指数：R2灵敏度至少可以达到103copy/ml·同样存在PCR产物自身退火引起的rcDNA非特异性扩增的问题·由于灵敏度较普通PCR高，假阳性率比普通PCR更高质粒标准品107copy/ml解决方案2.侵入者探针法(Invaderassay)侵入者探针法定量检测cccDNA的优缺点3.嵌合引物荧光PCR法外来压力：打破病毒含量自身恒定的结果细胞核内cccDNA含量的相对稳定性，决定了长疗程抗病毒治疗的必要性含量的较低），血清中含量？1cDNA池的自身恒定侵入者探针法(Invaderassay)两种特殊的探针：invaderprobe和primaryprobe，后者含与待测模板无关的5’侧翼的碱基片段。·现有技术灵敏度不高，检测低限104copy现有的几种cccDNA检测技术简介N：与HBVDNA非同源片段·多种同源的乙肝病毒DNA分子并存(cccDNA、Kock等：反应管中rcDNA含量不能超过105copycccDNA存在于细胞核内，成为乙肝病毒的复制“池”标准曲线方程YCtcopy·前期研究主要集中于细胞模型和动物肝脏Shao,etal.标准曲线方程YCtcopy嵌合引物荧光PCR的优缺点无论是选择性荧光PCR，还是侵入者探针法或嵌合引物荧光PCR，本身都不能解决在高rcDNA背景条件下的假阳性问题，必须结合抽提分离、酶切纯化等步骤，以提高特异性。三、影响cccDNA池的因素1cDNA池的自身恒定2.抗病毒药物对cccDNA的影响3.肝外组织也是cccDNA的储存池？(2)关于血清中是否存在cccDNA的问题谢谢观看！感谢观看